1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被證實(shí)是胸腺嘧啶核苷(簡稱胸苷)合成DNA的關(guān)鍵酶,隨后的研究表明 [1] ,TK有兩種同工酶,為細(xì)胞質(zhì)TK(TK 1 )和線粒體TK(TK 2 ),其中TK 1 與細(xì)胞分裂密切相關(guān),在細(xì)胞分裂G 1 期含量比較低,到S期后逐漸升高,至G 2 期達(dá)到最高,因此,編碼TK 1 的mRNA及其表達(dá)的蛋白質(zhì)也就成為細(xì)胞增生的標(biāo)志物。目前,實(shí)驗(yàn)室主要采用放射免疫法(RIA)檢測血清TK的酶活性,由于 125 I標(biāo)記脫氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,難于在臨床上推廣。1996年He等 [2] 報(bào)道利用抗 TK 1 多克隆抗體,建立western blotting檢測人TK 1 。在此基礎(chǔ)上,我們利用抗 TK 1 單克隆抗體,建立點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測乳腺腫瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺腫瘤診斷、療效觀察、預(yù)后及腫瘤病理機(jī)制的研究,在鑒定良、惡性乳腺腫瘤取得了良好效果,現(xiàn)初步報(bào)告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究對象:共檢測118例患者,其中乳腺腫瘤患者75例,來源于湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和Karolinska醫(yī)院,經(jīng)病理學(xué)確診,乳腺癌61例(手術(shù)前患者14例,淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者37例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者10例),乳腺良性腫瘤14例;對照組43例,其中11名為本院體檢健康者,32例為本院非腫瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺結(jié)核10例)。所有研究對象采集靜脈血,分離血清,貯存于-20℃?zhèn)溆谩?
2 硝酸纖維素薄膜(NCM),孔徑0.45μm,規(guī)格10cm×8cm,浙江黃巖四青生化材料廠生產(chǎn)。
　　 3 主要試劑和儀器:TK 1 單克隆抗體,生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體(bio anti M),辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(avidin HRP),TK 1 標(biāo)準(zhǔn)品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),魯米諾發(fā)光底物和X線片均由瑞典Karolinska大學(xué)提供。GS700圖像掃描儀為美國Bio Rad公司產(chǎn)品。
　　 二、方法
　　 1 點(diǎn)樣,在NCM上每點(diǎn)加血清5μl,同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對照(每次測定NCM都有標(biāo)準(zhǔn)品),室溫晾干,洗滌3次,每次5min。將NCM37℃振蕩封閉2ｈ,加入適量的TK 1 單抗于封閉液中,4℃振蕩過夜,漂洗3次,將NCM放于Bio anti M液中,室溫振蕩作用1ｈ,洗滌同前。加入適當(dāng)濃度的avidin HRP于NCM容器中,室溫1ｈ,洗滌4次。將NCM置于新鮮配制的發(fā)光底物中,室溫1min,用塑料膜將NCM封好,排除氣泡,裝于密封夾內(nèi),暗室中放入X線片,曝光3min(30min內(nèi)完成),取片沖洗。
　　 2 結(jié)果分析,用GS 700圖像掃描儀測定各斑點(diǎn)的吸光度值(A),以標(biāo)準(zhǔn)品的含量對應(yīng)A值作圖進(jìn)行定量分析,凡是TK 1 濃度大于5pmol/L可判定為異常;也可通過肉眼觀察定性分析,斑點(diǎn)顏色深于5pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品,即為TK 1 陽性。
　　 三、Western Immunoblottinhg檢測血清TK 1 詳細(xì)操作方法參見有關(guān)文獻(xiàn) [2] 。
  檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)新技術(shù)進(jìn)展 
免疫印跡法測定乳腺腫瘤患者胸苷激酶
 
湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 李艷
 
 
　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被證實(shí)是胸腺嘧啶核苷(簡稱胸苷)合成DNA的關(guān)鍵酶,隨后的研究表明 [1] ,TK有兩種同工酶,為細(xì)胞質(zhì)TK(TK 1 )和線粒體TK(TK 2 ),其中TK 1 與細(xì)胞分裂密切相關(guān),在細(xì)胞分裂G 1 期含量比較低,到S期后逐漸升高,至G 2 期達(dá)到最高,因此,編碼TK 1 的mRNA及其表達(dá)的蛋白質(zhì)也就成為細(xì)胞增生的標(biāo)志物。目前,實(shí)驗(yàn)室主要采用放射免疫法(RIA)檢測血清TK的酶活性,由于 125 I標(biāo)記脫氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,難于在臨床上推廣。1996年He等 [2] 報(bào)道利用抗 TK 1 多克隆抗體,建立western blotting檢測人TK 1 。在此基礎(chǔ)上,我們利用抗 TK 1 單克隆抗體,建立點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測乳腺腫瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺腫瘤診斷、療效觀察、預(yù)后及腫瘤病理機(jī)制的研究,在鑒定良、惡性乳腺腫瘤取得了良好效果,現(xiàn)初步報(bào)告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究對象:共檢測118例患者,其中乳腺腫瘤患者75例,來源于湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和Karolinska醫(yī)院,經(jīng)病理學(xué)確診,乳腺癌61例(手術(shù)前患者14例,淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者37例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者10例),乳腺良性腫瘤14例;對照組43例,其中11名為本院體檢健康者,32例為本院非腫瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺結(jié)核10例)。所有研究對象采集靜脈血,分離血清,貯存于-20℃?zhèn)溆谩?

　　 2 硝酸纖維素薄膜(NCM),孔徑0.45μm,規(guī)格10cm×8cm,浙江黃巖四青生化材料廠生產(chǎn)。
　　 3 主要試劑和儀器:TK 1 單克隆抗體,生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體(bio anti M),辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(avidin HRP),TK 1 標(biāo)準(zhǔn)品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),魯米諾發(fā)光底物和X線片均由瑞典Karolinska大學(xué)提供。GS700圖像掃描儀為美國Bio Rad公司產(chǎn)品。
　　 二、方法
　　 1 點(diǎn)樣,在NCM上每點(diǎn)加血清5μl,同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對照(每次測定NCM都有標(biāo)準(zhǔn)品),室溫晾干,洗滌3次,每次5min。將NCM37℃振蕩封閉2ｈ,加入適量的TK 1 單抗于封閉液中,4℃振蕩過夜,漂洗3次,將NCM放于Bio anti M液中,室溫振蕩作用1ｈ,洗滌同前。加入適當(dāng)濃度的avidin HRP于NCM容器中,室溫1ｈ,洗滌4次。將NCM置于新鮮配制的發(fā)光底物中,室溫1min,用塑料膜將NCM封好,排除氣泡,裝于密封夾內(nèi),暗室中放入X線片,曝光3min(30min內(nèi)完成),取片沖洗。
　　 2 結(jié)果分析,用GS 700圖像掃描儀測定各斑點(diǎn)的吸光度值(A),以標(biāo)準(zhǔn)品的含量對應(yīng)A值作圖進(jìn)行定量分析,凡是TK 1 濃度大于5pmol/L可判定為異常;也可通過肉眼觀察定性分析,斑點(diǎn)顏色深于5pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品,即為TK 1 陽性。
　　 三、Western Immunoblottinhg檢測血清TK 1 詳細(xì)操作方法參見有關(guān)文獻(xiàn) [2] 。

結(jié)果　
　 　 一、特異性
　　 1 對照實(shí)驗(yàn):取1份TK 1 陽性血清,分別設(shè)立TK 1 單抗、Bio anti M及avidin HRP空白對照,經(jīng)點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法測定,發(fā)現(xiàn)三者對照點(diǎn)均不顯色。
　　 2 TK 1 分子量驗(yàn)證:取10份TK 1 陽性和5份TK 1 陰性血清,40%硫酸銨沉淀,取上清液透析,再進(jìn)行 Western Immunoblottinhg,結(jié)果TK 1 陽性血清在分子量25000處均有顯色條帶,TK 1 陰性血清無顯色。
　　 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不同含量標(biāo)準(zhǔn)品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),經(jīng)過點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法測定后,用GS 700圖像掃描儀測定各斑點(diǎn)的A值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　 三、重復(fù)性試驗(yàn)
　　 兩份乳腺腫瘤患者血清,應(yīng)用點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法在同一NCM上重復(fù)測定20次,結(jié)果:病例1的TK 1 含量為194pmol/L,標(biāo)準(zhǔn)差為12;病例2血清的TK 1 含量為49pmol/L,標(biāo)準(zhǔn)差為2 1,兩者的批內(nèi)CV分別為0.062和0.043。
　　 四、標(biāo)本檢測各組人群血清TK 1 的含量比較見表1;用點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測血清的X線片結(jié)果。
五、乳腺腫瘤患者術(shù)后TK 1 的動(dòng)態(tài)變化　 對1例乳腺良性腫瘤患者手術(shù)后0、26、37ｄ的血清進(jìn)行檢測,TK 1 分別為9.1、2.5、4.9pmol/L;而另1例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者術(shù)后0、21、28、65、77、92ｄ的血清TK 1 分別為91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/L。結(jié)果表明,當(dāng)患者完全康復(fù)時(shí),TK 1 呈明顯下降趨勢。
  檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)新技術(shù)進(jìn)展 
免疫印跡法測定乳腺腫瘤患者胸苷激酶
 
湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科 李艷
 
 
　　 1960年胸腺嘧啶核苷激酶(TK)被證實(shí)是胸腺嘧啶核苷(簡稱胸苷)合成DNA的關(guān)鍵酶,隨后的研究表明 [1] ,TK有兩種同工酶,為細(xì)胞質(zhì)TK(TK 1 )和線粒體TK(TK 2 ),其中TK 1 與細(xì)胞分裂密切相關(guān),在細(xì)胞分裂G 1 期含量比較低,到S期后逐漸升高,至G 2 期達(dá)到最高,因此,編碼TK 1 的mRNA及其表達(dá)的蛋白質(zhì)也就成為細(xì)胞增生的標(biāo)志物。目前,實(shí)驗(yàn)室主要采用放射免疫法(RIA)檢測血清TK的酶活性,由于 125 I標(biāo)記脫氧尿嘧啶半衰期短,且具有放射性污染,難于在臨床上推廣。1996年He等 [2] 報(bào)道利用抗 TK 1 多克隆抗體,建立western blotting檢測人TK 1 。在此基礎(chǔ)上,我們利用抗 TK 1 單克隆抗體,建立點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測乳腺腫瘤患者血清中TK 1 ,可用于乳腺腫瘤診斷、療效觀察、預(yù)后及腫瘤病理機(jī)制的研究,在鑒定良、惡性乳腺腫瘤取得了良好效果,現(xiàn)初步報(bào)告如下。

材料和方法
　　 　 一、材料
　　 1 研究對象:共檢測118例患者,其中乳腺腫瘤患者75例,來源于湖北醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和Karolinska醫(yī)院,經(jīng)病理學(xué)確診,乳腺癌61例(手術(shù)前患者14例,淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者37例,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的手術(shù)后患者10例),乳腺良性腫瘤14例;對照組43例,其中11名為本院體檢健康者,32例為本院非腫瘤住院患者(乳腺炎10例,乙型肝炎12例,肺結(jié)核10例)。所有研究對象采集靜脈血,分離血清,貯存于-20℃?zhèn)溆谩?

　　 2 硝酸纖維素薄膜(NCM),孔徑0.45μm,規(guī)格10cm×8cm,浙江黃巖四青生化材料廠生產(chǎn)。
　　 3 主要試劑和儀器:TK 1 單克隆抗體,生物素標(biāo)記的羊抗鼠抗體(bio anti M),辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素(avidin HRP),TK 1 標(biāo)準(zhǔn)品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),魯米諾發(fā)光底物和X線片均由瑞典Karolinska大學(xué)提供。GS700圖像掃描儀為美國Bio Rad公司產(chǎn)品。
　　 二、方法
　　 1 點(diǎn)樣,在NCM上每點(diǎn)加血清5μl,同時(shí)設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對照(每次測定NCM都有標(biāo)準(zhǔn)品),室溫晾干,洗滌3次,每次5min。將NCM37℃振蕩封閉2ｈ,加入適量的TK 1 單抗于封閉液中,4℃振蕩過夜,漂洗3次,將NCM放于Bio anti M液中,室溫振蕩作用1ｈ,洗滌同前。加入適當(dāng)濃度的avidin HRP于NCM容器中,室溫1ｈ,洗滌4次。將NCM置于新鮮配制的發(fā)光底物中,室溫1min,用塑料膜將NCM封好,排除氣泡,裝于密封夾內(nèi),暗室中放入X線片,曝光3min(30min內(nèi)完成),取片沖洗。
　　 2 結(jié)果分析,用GS 700圖像掃描儀測定各斑點(diǎn)的吸光度值(A),以標(biāo)準(zhǔn)品的含量對應(yīng)A值作圖進(jìn)行定量分析,凡是TK 1 濃度大于5pmol/L可判定為異常;也可通過肉眼觀察定性分析,斑點(diǎn)顏色深于5pmol/L標(biāo)準(zhǔn)品,即為TK 1 陽性。
　　 三、Western Immunoblottinhg檢測血清TK 1 詳細(xì)操作方法參見有關(guān)文獻(xiàn) [2] 。

結(jié)果　
　 　 一、特異性
　　 1 對照實(shí)驗(yàn):取1份TK 1 陽性血清,分別設(shè)立TK 1 單抗、Bio anti M及avidin HRP空白對照,經(jīng)點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法測定,發(fā)現(xiàn)三者對照點(diǎn)均不顯色。
　　 2 TK 1 分子量驗(yàn)證:取10份TK 1 陽性和5份TK 1 陰性血清,40%硫酸銨沉淀,取上清液透析,再進(jìn)行 Western Immunoblottinhg,結(jié)果TK 1 陽性血清在分子量25000處均有顯色條帶,TK 1 陰性血清無顯色。
　　 二、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不同含量標(biāo)準(zhǔn)品(0、5、10、20、40、80、160pmol/L),經(jīng)過點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法測定后,用GS 700圖像掃描儀測定各斑點(diǎn)的A值,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度值為橫坐標(biāo),A值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。

　　 三、重復(fù)性試驗(yàn)
　　 兩份乳腺腫瘤患者血清,應(yīng)用點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法在同一NCM上重復(fù)測定20次,結(jié)果:病例1的TK 1 含量為194pmol/L,標(biāo)準(zhǔn)差為12;病例2血清的TK 1 含量為49pmol/L,標(biāo)準(zhǔn)差為2 1,兩者的批內(nèi)CV分別為0.062和0.043。
　　 四、標(biāo)本檢測各組人群血清TK 1 的含量比較見表1;用點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測血清的X線片結(jié)果見圖2。

　　 五、乳腺腫瘤患者術(shù)后TK 1 的動(dòng)態(tài)變化　 對1例乳腺良性腫瘤患者手術(shù)后0、26、37ｄ的血清進(jìn)行檢測,TK 1 分別為9.1、2.5、4.9pmol/L;而另1例淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者術(shù)后0、21、28、65、77、92ｄ的血清TK 1 分別為91.8、39.7、50.7、20.2、17.5、3.8pmol/L。結(jié)果表明,當(dāng)患者完全康復(fù)時(shí),TK 1 呈明顯下降趨勢。

討論
　　 　 正常人細(xì)胞中TK 1 的含量極低,只是在細(xì)胞過度增生的情況下,才出現(xiàn)高的水平,Ellime等 [3] 報(bào)道,惡性貧血患者血清中TK的含量是正常人的40倍,且能作為一些癌癥發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的重要指標(biāo)。我們利用抗TK 1 mAb,建立點(diǎn)免疫印發(fā)光法檢測乳腺腫瘤患者血清中TK 1 ,通過對方法特異性、重復(fù)性的考查,以及經(jīng) Western Immuno blottinhg的驗(yàn)證,表明該方法簡便易行,可用于血清TK 1 的檢測。
　　 從本研究結(jié)果看,乳腺癌患者血清TK 1 水平明顯高于乳腺良性腫瘤患者,而后者與體檢健康者TK 1 無明顯差別(Ｐ＞0.05),對于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者,手術(shù)后TK 1 水平呈明顯下降的趨勢。因此,血清TK 1 不僅可以作為乳腺癌診斷的一個(gè)敏感性指標(biāo),而且也有利于乳腺癌的療效觀察。雖然乳腺癌患者血清TK 1 水平明顯高于對照人群,但是乳腺癌患者間TK 1 水平也有差別,可能與腫瘤細(xì)胞分化程度和所處細(xì)胞周期及腫瘤是否轉(zhuǎn)移有關(guān),有待進(jìn)一步研究。
　　 血清TK 1 的來源仍不十分清楚,而且它比細(xì)胞內(nèi)提取的TK 1 更穩(wěn)定,同時(shí),血清TK 1 的水平與腫瘤的性質(zhì)有關(guān),因此,有學(xué)者 [4] 推測,血清TK 1 可能是腫瘤細(xì)胞分泌或溶解釋放胸苷激酶的聚合體。
　　 國外已有報(bào)道,應(yīng)用酶法 [3] 和Western Blotting [2] 檢測血清中TK 1 ,且能進(jìn)行定量分析。但因這些方法操作繁瑣,難以用于臨床。我們認(rèn)為點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法容易操作,而且利用了發(fā)光技術(shù)的高靈敏性,通過X線片曝光,避免了使用發(fā)光檢測儀,且可長期保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果;通過設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品對照,根據(jù)斑點(diǎn)的深淺進(jìn)行定量分析。因此,點(diǎn)免疫印跡發(fā)光法檢測血清TK 1 可作為乳腺腫瘤診斷方法之一,尤其判斷良惡性乳腺腫瘤具有很好的應(yīng)用前景。