常用的分離方法有細胞接種和乳鼠接種。1998年人們開始用人肺系細胞(MRC-5)分離Cox A16等毒株，其敏感性好且接種病毒后出現(xiàn)細胞病變較快。人源細胞如W1-38、橫紋肌瘤細胞(RD)也都可用于病毒分離。RD細胞支持大多數(shù)柯薩奇A組病毒復(fù)制，但一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯病變，若在使用RD 細胞分離的同時再增加1株L20B或Hep-2細胞，可提高腸道病毒的分離率。為提高細胞對腸道病毒的敏感性，還可在細胞接種前用50μg/ml的5-碘脫氧尿嘧啶處理3天。對一些不能在細胞上生長的病毒，可用乳鼠接種分離病毒。�？刹《疽话悴灰�起乳鼠發(fā)病,多由腦脊液分離,糞便中不易檢出。

腸道病毒型特異性鑒定主要靠血清中和實驗，LMB組合血清可大大簡化鑒定過程，但是有些毒株的中和作用不穩(wěn)定，仍需由單價血清來鑒定，另一要注意的是病毒顆粒的集聚會影響中和效果，如EV 71的中和實驗就需要使用單個分散的病毒。

近年來，PCR 技術(shù)已成為診斷腸道病毒感染最常用的一種方法。PCR測序技術(shù)則可用于腸道病毒分型。

手足口病抗體檢測的最常用方法目前仍是中和實驗，該方法精確且具有型特異性。