常用的分離方法有細(xì)胞接種和乳鼠接種。1998年人們開始用人肺系細(xì)胞(MRC-5)分離Cox A16等毒株，其敏感性好且接種病毒后出現(xiàn)細(xì)胞病變較快。人源細(xì)胞如W1-38、橫紋肌瘤細(xì)胞(RD)也都可用于病毒分離。RD細(xì)胞支持大多數(shù)柯薩奇A組病毒復(fù)制，但一般要經(jīng)過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯病變，若在使用RD 細(xì)胞分離的同時(shí)再增加1株L20B或Hep-2細(xì)胞，可提高腸道病毒的分離率。為提高細(xì)胞對(duì)腸道病毒的敏感性，還可在細(xì)胞接種前用50μg/ml的5-碘脫氧尿嘧啶處理3天。對(duì)一些不能在細(xì)胞上生長(zhǎng)的病毒，可用乳鼠接種分離病毒。埃可病毒一般不引起乳鼠發(fā)病,多由腦脊液分離,糞便中不易檢出。

腸道病毒型特異性鑒定主要靠血清中和實(shí)驗(yàn)，LMB組合血清可大大簡(jiǎn)化鑒定過程，但是有些毒株的中和作用不穩(wěn)定，仍需由單價(jià)血清來鑒定，另一要注意的是病毒顆粒的集聚會(huì)影響中和效果，如EV 71的中和實(shí)驗(yàn)就需要使用單個(gè)分散的病毒。

近年來，PCR 技術(shù)已成為診斷腸道病毒感染最常用的一種方法。PCR測(cè)序技術(shù)則可用于腸道病毒分型。

手足口病抗體檢測(cè)的最常用方法目前仍是中和實(shí)驗(yàn)，該方法精確且具有型特異性。